Por: Dr. Celso Granato, Dr. Jorge Luiz Mello Sampaio e Dra. Carolina S. Lázari?

Já está disponível uma tecnologia molecular baseada em hibridação de ácidos nucleicos por array para o diagnóstico simultâneo de múltiplos vírus respiratórios, com sensibilidade superior à detecção antigênica, devido à amplificação inicial do analito.

Nessa técnica, o passo inicial é a amplificação, por PCR, da sequência-alvo do material genético de cada agente infeccioso pesquisado. Para a análise concomitante dos diversos vírus, o método lança mão da combinação de enzimas específicas, como a transcriptase reversa e várias polimerases distintas, permitindo, desse modo, a amplificação de segmentos de ácidos nucleicos, sejam de RNA, sejam de DNA. Isto é, os vírus cujo material genético constitui-se de RNA passam, primeiro, por transcrição reversa, gerando segmentos de cDNA, que, a seguir, terão suas regiões gênicas específicas amplificadas juntamente com as dos DNA-vírus.

Para que seja possível a identificação diferencial, inclusive nos casos de coinfecção, a seleção prévia de regiões-alvo conservadas e passíveis de discriminação entre as espécies virais é outro fator crucial. Ensaios que detectam muitos agentes avaliam mais de uma região do genoma de cada um para sua identificação – em alguns casos, até sete. Para estes, a hibridação de ácidos nucleicos é de grande valia, em virtude da captura dos fragmentos amplificados por segmentos de DNA únicos.

Os segmentos de DNA únicos são sequências de nucleotídeos correspondentes às regiões-alvo dos agentes virais pesquisados, produzidas sinteticamente e roboticamente aplicadas a lâminas ou a minitubos. Presos em conjunto a essas superfícies inertes, os segmentos únicos de DNA são denominados arrays. Ao interagirem com os produtos de PCR, esses oligonucleotídeos são passíveis de hibridação com os segmentos gênicos amplificados e sinalizam, por meio de moléculas fluorescentes ou quimioluminescentes, a presença de determinado agente na amostra.

A composição dos arrays permite à técnica de hibridação avaliar diversos segmentos gênicos – e, portanto, múltiplas espécies de agentes infecciosos – ao mesmo tempo, caracterizando-a como multiplex.

As moléculas sinalizadoras são capazes de apontar as regiões do array onde ocorreu a captura do fragmento de ácido nucleico viral. A definição prévia da localização de cada segmento “isca” e a análise por elaborados softwares de imagem possibilitam a automação da tecnologia, bem como eliminam avaliações subjetivas dos resultados obtidos.

Em recente estudo realizado para validação de um kit comercial baseado em hibridação de ácidos nucleicos por array para a detecção simultânea de 17 vírus respiratórios, pesquisadores utilizaram, como referência, um painel de ID que identifica antígenos de vírus sincicial respiratório, influenza tipos A e B, adenovírus e parainfluenza 1, 2 e 3 em lavado de nasofaringe. Além de obter 97% de concordância entre os resultados das amostras positivas, a plataforma por hibridação acusou presença viral em 69,3% das que estavam inicialmente negativas na imunofluorescência. Destas, 44% tinham agentes passíveis de detecção pela ID, o que demonstra maior sensibilidade do método em estudo; enquanto as demais continham vírus não contemplados no painel, o que evidencia seu maior poder diagnóstico.

O teste reforça o arsenal de exames laboratoriais para o diagnóstico da etiologia viral das infecções respiratórias. Essas ferramentas podem ajudar a diminuir a prescrição desnecessária de antibióticos e a implementar tratamentos antivirais eficazes – sobretudo no contexto das síndromes agudas graves e dos pacientes com imunossupressão –, além de contribuírem para a prevenção da transmissão dos vírus respiratórios. Ademais, a maior precisão diagnóstica e terapêutica pode acarretar redução do tempo de internação, do uso de antibióticos e de testes laboratoriais, racionalizando custos. Tal análise justifica a aplicação dessas tecnologias na rotina clínica, uma vez que elas trazem benefícios tanto individualmente, para os pacientes, quanto do ponto de vista coletivo.

Vírus pesquisados pelo teste:
• Influenza A (sazonal, H3N2 e H1N1-2009), B e C
• Adenovírus
• Vírus respiratório sincicial A e B
• Rinovírus
• Coronavírus
• Parainfluenza 1, 2, 3 e 4
• Metapneumovírus
• Bocavírus
• Enterovírus

Fonte: http://www.fleury.com.br/